經典古方下瘀血湯（XYXD）通過重塑腸道菌群平衡，激活FXR-SHP軸以維持膽汁酸穩態，并最終調控m?A轉錄后修飾影響花生四烯酸（AA）代謝，從而多維度緩解代謝相關脂肪性肝炎（MASH）。成果發表在Phytomedicine期刊（IF：8.3）
Phytomedicine 是一本專注于植物療法、天然產物及傳統藥物（包括中藥）藥理活性研究的國際同行評審期刊。期刊創刊于1994年，由愛思唯爾（Elsevier）出版。該刊涵蓋植物藥理學、毒理學、臨床療效及藥物相互作用等主題，尤其關注天然產物在治療人類疾病中的科學證據。最新影響因子（IF）為8.3（2025年數據），5年影響因子為8，屬于中科院醫學一區（Top期刊）。由愛思唯爾出版，印刷國際標準連續出版物號（ISSN）為0944-7113。
研究背景：
代謝相關脂肪性肝病（MAFLD）是常見的慢性肝病，其中約33%-50%的患者可能發展為代謝相關脂肪性肝炎（MASH）。MASH可進展為肝硬化甚至肝細胞癌（HCC），是肝移植的第二大原因，但有效治療藥物匱乏。MASH的發病機制復雜，涉及肥胖、胰島素抵抗、炎癥和纖維化等多重因素。近年來，“腸-肝軸"理論成為研究熱點：腸道菌群失調及其代謝物（尤其是膽汁酸BA）的改變，通過門靜脈進入肝臟，觸發炎癥反應，驅動MASH進展。法尼醇X受體（FXR）是維持膽汁酸穩態的核心核受體，其活性受腸道菌群代謝物的精細調控。此外，N?-甲基腺苷（m?A）這一表觀轉錄組修飾也被發現與肝臟炎癥密切相關，并可能受菌群代謝物（如膽汁酸）的調節。然而，天然復方如何通過“腸-肝軸"系統性調控MASH，其具體機制尚不明確。下瘀血湯（XYXD）是源自張仲景《金匱要略》的經典方劑，由大黃、桃子和土鱉蟲組成。既往研究證實其對肝纖維化和肝癌有改善作用，但其對MASH的治療效果及通過“腸-肝軸"的具體機制尚未闡明。
研究方法：
研究人員通過MCD飲食誘導C57BL/6J小鼠MASH模型，給予低劑量和高劑量XYXD干預，以奧貝膽酸（OCA）為陽性對照。為明確XYXD的化學物質基礎，團隊利用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS對XYXD提取物進行指紋圖譜及17種標志性成分的含量測定。在表型評估層面，采用試劑盒檢測血清ALT、AST及肝臟TG水平，并結合H&E、油紅O及天狼星紅染色評價肝臟病理改變。在機制探索層面，通過16S rRNA基因測序分析腸道菌群組成；利用LC-MS/MS技術定量檢測血清、肝臟和糞便中39種膽汁酸及花生四烯酸（AA）代謝物；通過Dot blotting和MeRIP-qPCR檢測整體及特定基因（如Fads1）的m?A修飾水平。此外，利用脫氧膽酸（DCA）刺激RAW264.7巨噬細胞，并加入XYXD含藥血清，通過RT-qPCR、Western blot及Dot blotting驗證DCA對m?A修飾和炎癥的調控作用。上述方法的整合，從化學成分、動物表型、腸道菌群、代謝物譜到表觀轉錄組修飾，多維度證明了XYXD通過“菌群-膽汁酸-m?A-脂質代謝"軸治療MASH的核心機制。
主要研究結果：
1. XYXD的化學成分分析
采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜（UHPLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS）技術，對下瘀血湯（XYXD）總提取物及17種對照品混合物進行分析，獲取了典型的指紋圖譜，并附有相應標志性化合物的化學結構圖。同時定量測定了17種標志性化合物的含量，為后續藥效學研究的物質基礎提供了依據。其中苦杏仁苷含量最高（8.13 mg/g），兒茶素含量極低（0.00035 mg/g）。
圖1，UHPLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS鑒定XYXD成分
2. 下瘀血湯（XYXD）能有效改善MCD飲食誘導的小鼠MASH
為明確下瘀血湯（XYXD）對MASH的治療效果，研究者采用MCD飲食誘導小鼠MASH模型，給予低劑量（2.6 g/kg）和高劑量（5.2 g/kg）XYXD口服治療，以奧貝膽酸（OCA）為陽性對照。結果顯示，與MCS正常對照組相比，MCD模型組小鼠肝臟呈彌漫性黃色，血清ALT、AST及肝臟TG水平均顯著升高（P < 0.001），H&E、天狼星紅及油紅O染色顯示嚴重的脂肪變性、膠原沉積和脂質積聚。經XYXD和OCA治療后，肝臟顏色和質地顯著改善，ALT、AST及TG水平顯著降低（P < 0.05或P < 0.01），病理染色顯示的脂肪變性、炎癥浸潤、膠原沉積和脂質積聚均明顯減輕，NAS評分也顯著降低。以上結果表明，XYXD能夠有效緩解MCD飲食誘導的小鼠MASH。
圖2，XYXD有效改善MCD飲食誘導的小鼠MASH
3. XYXD調控MASH中的脂代謝
為闡明XYXD在MASH中對脂代謝的調控作用，研究者檢測了脂代謝相關關鍵基因的mRNA及蛋白表達水平，包括脂肪酸攝取基因（CD36、CIDEC、PLIN2）、膽gu醇轉運基因（DGAT1）、脂肪酸合成基因（SREBP1c、FASN）以及脂肪酸β-氧化基因（CPT1a、ACOX1）。結果顯示，與MCS組相比，MCD組小鼠肝臟中CD36、CIDEC、PLIN2、DGAT1、SREBP1c和FASN的mRNA表達水平均顯著升高（P < 0.001），而CPT1a和ACOX1的表達水平顯著降低（P < 0.001）。經XYXD和OCA治療后，上述基因的表達變化均被顯著逆轉（P < 0.01）。Western blot結果進一步證實，XYXD治療顯著下調了CD36和SREBP1c的蛋白表達水平，同時上調了CPT1a的蛋白表達水平。以上結果證實，XYXD能夠調節MCD誘導的MASH小鼠的脂代謝紊亂。
4. XYXD改善MASH鼠炎癥反應和纖維化
為探討XYXD對MASH炎癥和纖維化的影響，研究者檢測了炎癥及纖維化相關指標。結果顯示，與MCS組相比，MCD組小鼠肝臟中促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA及蛋白表達水平均顯著升高（P < 0.05），巨噬細胞極化標記物CD11b和F4/80的mRNA表達也顯著升高（P < 0.001），免疫熒光和免疫組化染色進一步證實CD11b和F4/80呈陽性表達。經XYXD和OCA治療后，上述促炎因子和巨噬細胞標記物的表達均顯著降低（P < 0.05或P < 0.001）。此外，天狼星紅染色顯示XYXD治療可改善MCD小鼠的纖維沉積，纖維化相關基因α-SMA和COL1A1的mRNA表達也顯著下調。以上結果表明，XYXD能夠有效減輕MASH小鼠的炎癥反應和纖維化進程。
圖4，XYXD改善MASH 鼠炎癥反應和纖維化
5. XYXD調控MASH鼠腸道菌群
為探究XYXD對MASH小鼠腸道菌群的調節作用，研究者對糞便樣本進行了16S rRNA基因測序分析。結果顯示，與MCS組相比，MCD模型小鼠腸道菌群的α多樣性降低，厚壁菌門（Firmicutes）與擬桿菌門（Bacteroidetes）的比值升高。經XYXD治療后，上述菌群失調被顯著逆轉：XYXD顯著增加了有益菌如擬桿菌屬（Bacteroides）、副擬桿菌屬（Parabacteroides） 及多形擬桿菌（Bacteroides thetaiotaomicron） 的豐度，同時降低了促炎菌如糞桿菌屬（Faecalibaculum） 和乳酸桿菌屬（Lactobacillus） 的豐度。LEfSe分析進一步揭示了各組間的差異菌群特征。以上結果表明，XYXD能夠有效重塑MASH小鼠的腸道菌群結構，恢復菌群穩態。
圖5，XYXD對MCD飲食誘導的MASH小鼠腸道菌群失調的影響
6. XYXD調節膽汁酸代謝
為探究XYXD對MASH小鼠膽汁酸（BA）代謝的調控作用，研究者檢測了血清總膽汁酸（TBA）水平及BA代謝相關基因和蛋白的表達。結果顯示，與MCS組相比，MCD組小鼠血清TBA含量顯著升高，同時肝臟中FXR、SHP、CYP27A1、MRP3和NTCP的mRNA水平顯著降低（P < 0.001），而膽汁酸合成限速酶CYP7A1的mRNA水平顯著升高（P < 0.001）。經XYXD治療后，FXR、SHP、CYP27A1、MRP3和BSEP的mRNA表達顯著升高（P < 0.01或P < 0.05），CYP7A1的表達被顯著下調（P < 0.01）。Western blot結果進一步證實，XYXD干預后FXR、SHP和BSEP的蛋白表達水平顯著升高，而CYP7A1的蛋白表達顯著降低。以上結果表明，XYXD通過激活FXR-SHP信號通路，有效調節了MASH小鼠的膽汁酸代謝穩態。
圖7，XYXD對MASH小鼠血清、肝臟和糞便中膽汁酸（BA）含量的影響
7. XYXD通過降低脫氧膽酸（DCA）水平來調控m?A修飾
為探究XYXD是否通過調節m?A修飾發揮作用，研究者檢測了小鼠肝臟m?A水平及相關基因表達。結果顯示，MCD組小鼠肝臟m?A水平顯著升高，而XYXD處理后顯著降低了m?A水平。進一步研究發現，XYXD顯著降低了血清和肝臟中脫氧膽酸（DCA）的含量，以及腸道中產DCA的關鍵菌屬——梭菌屬（Clostridium）的豐度，同時下調了催化CA轉化為DCA的功能基因baiE的表達。體外實驗證實，DCA刺激RAW264.7巨噬細胞可顯著上調m?A水平及m?A甲基轉移酶METTL3/METTL14的表達，并促進炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達；而XYXD含藥血清處理可顯著逆轉DCA誘導的這些效應。相比之下，牛磺膽酸（TCA）對m?A水平無明顯影響。以上結果表明，XYXD通過減少腸道梭菌屬豐度、降低DCA水平，進而下調m?A修飾，減輕炎癥反應。
圖8，XYXD和DCA均可調控m?A的水平
8. XYXD通過m6A修飾調控花生四烯酸代謝，從而抑制環氧合酶和脂氧合酶信號通路。
在本部分中，研究者主要探討了XYXD通過m6A修飾調控花生四烯酸（AA）代謝，從而抑制環氧合酶（COX）和脂氧合酶（LOX）信號通路。體外實驗顯示，脫氧膽酸（DCA）可上調巨噬細胞中FADS1的mRNA表達，增加AA含量，并降低二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）水平；而XYXD含藥血清則可逆轉這些變化。MeRIP-PCR結果表明，XYXD顯著下調FADS1的m6A修飾水平。在MASH小鼠模型中，XYXD處理可降低COX通路代謝產物PGE2、PGD2及LOX通路代謝產物15-HETE、5-HETE的水平，并抑制FADS1、PTGS1、PTGS2、ALOX5、ALOX12、ALOX15等關鍵基因及FADS1、ALOX5、COX2蛋白的表達。綜上，XYXD通過降低DCA含量、調控m6A修飾，進而抑制FADS1介導的AA合成及COX/LOX代謝通路，緩解MASH相關炎癥。
圖9，采用LC-MS/MS技術評估了花生四烯酸（AA）的代謝物
9. 全文總結
圖10，XYXD對MASH的保護機制示意圖
研究揭示了下瘀血湯（XYXD）通過“腸道菌群-膽汁酸-m?A修飾-花生四烯酸代謝"軸改善代謝相關脂肪性肝炎（MASH）的整合機制，創新性地將表觀轉錄修飾（m?A）與腸道微生物及脂質代謝聯系起來，證明了XYXD通過降低脫氧膽酸（DCA）水平、下調FADS1的m?A修飾、進而抑制COX/LOX炎癥通路的核心作用。研究亮點在于多組學聯用（16S rRNA、LC-MS/MS、MeRIP）及體內外驗證，系統闡明了中藥復方的多靶點機制。然而文章也有若干不足之處：未明確XYXD中具體哪種活性成分發揮關鍵作用；未在MASH患者中驗證該機制；對m?A修飾調控FADS1的直接證據（如突變實驗）尚待補充；此外，MCD模型雖常用但缺乏代謝綜合征背景（如肥胖、胰島素抵抗），可能影響結果向臨床的轉化。
